A5

Modellgestützte Steuerung der Kristallisierbarkeit von Proteinen
in biotechnologischen Prozessen

Proteine sind hierfür ausreichend gut kristallisierbar und molekulare Prozesse während der Kristallisation weitgehend unerforscht. Im Verlauf der dreijährigen Förderperiode konnten durch rationales Engineering der Kristallkontakte von Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase (LbADH) Varianten mit verbesserten Kristallisationskinetiken generiert werden. Mithilfe von Röntgenstrahl-Diffraktometrie und MD-Simulationen erzeugter LbADH-Varianten konnte gezeigt werden, dass rationales Protein-Engineering zu einer mechanistisch erklärbaren Verbesserung der Proteinkristallisation führt (Hermann et al. 2018, Nowotny et al. 2019).

Im vorliegenden dreijährigen Folgevorhaben soll zunächst eine Übertragung der gewonnenen Erkenntnisse auf ein verwandtes Enzym erfolgen. Es soll kristallographisch und molekulardynamisch untersucht werden, ob Mutationen, die die Kristallisation der LbADH verbessern konnten, in ähnlicher Weise die intermolekularen Kräfte bei der Kristallisation des verwandten Enzyms verstärken. Die experimentellen Ergebnisse sollen für die Validierung und Erweiterung der theoretischen Erkenntnisse genutzt werden.

Darauf aufbauend sollen diese Erkenntnisse zur Proteinkristallisation und deren Beeinflussung erstmalig für die de novo Kristallisation von zwei bisher nicht kristallisierbaren Proteinen nutzbar gemacht werden. Mithilfe von Homologiemodellen sollen zunächst Aminosäurepositionen bestimmt werden, die potentielle Kristallkontakte ausbilden können. Durch rationales Protein-Engineering soll nachfolgend eine Verstärkung der Wechselwirkungen an den Kristallkontakten herbeigeführt werden. Für die Vorhersage des Kristallisationsverhaltens sollen die überarbeiteten molekulardynamischen Methoden genutzt und nach experimenteller Evaluierung die molekularen Erkenntnisse zur Proteinkristallisation erweitert werden.

Die experimentelle Evaluierung soll sowohl durch die Charakterisierung des Phasenverhaltens der Proteine mithilfe von Hochdurchsatz-Screening Methoden als auch durch deren rheologische Charakterisierung in Lösung mithilfe der Hochfrequenzrheometrie erfolgen, um ein umfassendes Verständnis über den Zusammenhang des viskoelastischen Verhaltens gelöster Proteine und deren Kristallisationsneigung zu erlangen. Anschließend soll eine den Prozess analysierende Technologie (PAT) zur selektiven Quantifizierung von Konzentrationsänderungen des Zielproteins mittels UV/Vis Spektroskopie erarbeitet werden, um eine Echtzeitüberwachung der Kristallisation zu ermöglichen.

Parallel zu den experimentellen Arbeiten sollen MD-Simulationen die Änderung der freien Energie bei der in silico-Mutation einzelner Aminosäuren quantifizieren. Anhand eines thermodynamischen Kreislaufs soll so das Kristallisationsverhalten von Proteinmutanten vorhergesagt werden. Zusätzlich sollen am SuperMUC Höchstleistungsrechner des Leibniz Rechenzentrums der bayerischen Akademie der Wissenschaften in Garching sogenannte Advanced Sampling MD-Simulationen von hoch konzentrierten Proteinlösungen eine de novo-Kristallisation von bisher nicht kristallisierbaren Proteinen unterstützen.

Das gemeinsame Forschungsvorhaben von TUM und KIT umfasst von der molekularen Betrachtung (Protein-Engineering, Kristallographie und MD-Simulation) über die mikroskopische Skala (Kristallisationskinetik, Phasenverhalten und Rheologie) auch die makroskopische Skala (PAT), um so eine ganzheitliche, ingenieurwissenschaftliche Aufklärung grundlegender Prinzipien der technischen Proteinkristallisation zu ermöglichen.

Zuständiges Institut:

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Technische Universität München
Boltzmannstr. 15
85748 Garching

Postition Name E-Mail Telefon
Projektleiter: Prof. Dirk Weuster-Botz d.weuster-botz@lrz.tum.de 089-28915712
Projektleiter: Dr. Dariusch Hekmat hekmat@lrz.tum.de 089-28915770
Projektbearbeiter: Johannes Hermann j.hermann@lrz.tum.de 089-28915730
Projektbearbeiter: Phillip Nowotny p.nowotny@lrz.tum.de 089-28915726

◄ Zurück zu Projekten